Qué mide la HPLC
La cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa separa las especies presentes por hidrofobicidad. La pureza es la proporción del área total del cromatograma que corresponde al pico principal. Responde a cuánto material distinto acompaña al compuesto, no a qué molécula es ese pico.
Qué mide la espectrometría de masas
La ionización por electrospray acoplada a un analizador de masas determina la relación masa-carga de las especies ionizadas. Comparar la masa observada con la calculada a partir de la fórmula molecular confirma que la cadena sintetizada corresponde a la secuencia declarada.
Casos en que divergen
Un material puede mostrar 99% de área de pico y una masa que no corresponde a la secuencia declarada: el producto es homogéneo pero no es el compuesto anunciado. A la inversa, la masa correcta con un cromatograma de picos múltiples indica que el compuesto está presente pero acompañado de secuencias truncadas o aductos.
- Pureza alta + masa incorrecta: material homogéneo de identidad distinta.
- Pureza baja + masa correcta: compuesto correcto con impurezas de síntesis.
- Ambas conformes: base analítica mínima para trabajar con el lote.
Ensayos complementarios
El análisis de aminoácidos cuantifica el contenido neto de péptido; la cromatografía iónica identifica el contraión; el Karl Fischer determina el agua residual. Estas pruebas afectan directamente el cálculo de concentración molar.
Referencias
- Mant CT, Chen Y, Yan Z, et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods Mol Biol. 2007;386:3-55.
- Fenn JB, Mann M, Meng CK, Wong SF, Whitehouse CM. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 1989;246(4926):64-71.